細(xì)胞復(fù)蘇凍存注意事項(xiàng)
　　凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融
　　當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
　　如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。
　　慢凍程序
　　1.  標(biāo)準(zhǔn)程序：采用細(xì)胞凍存器
　　當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí)，  1~2 ℃/min；
　　當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí)， 5~10 ℃/min；
　　當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí)，可迅速放入液氮中。
　　2.  簡(jiǎn)易程序：將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內(nèi)降至液氮表面過夜，次晨投人液氮中。
　　3.  傳統(tǒng)程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽長期儲(chǔ)存。
　　細(xì)胞凍存方法
　　1.  預(yù)先配制凍存液
　?。?）10%DMSO + 細(xì)胞生長液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）
　　2.  取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液， 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml）。
　　3.  加入1 ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。液氮長期保存。
　　保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法
　　1.  快速解凍
　　凍存細(xì)胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動(dòng)冷凍管，使其在1 分鐘內(nèi)全部融化（不要超過3 分鐘）。
　　2.  解凍后的細(xì)胞可直接接種到含*生長培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng)，24小時(shí)后再用新鮮*培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，以去除DMSO。
　　3.  如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過離心去除冷凍保護(hù)劑，然后再接種到含*生長培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。